高效液相色谱（HPLC）是在气相色谱和经典液相色谱的理论上，经过仪器设备工艺的进步，做到弥补了气相色谱分析对待测物的局限性和传统液相色谱分析的不足之处。如示意图1.5所示，HPLC以液体为流动相，采用高压输液系统进行输液，色谱柱内填充不同类别填充物，使具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入色谱柱，流动相携带待检测物质在柱内进行不断吸附或解吸附等物理分离后，由于各类物质理化性质不同，按流出顺序进入检测器进行检测，从而实现对待测样品的分析。

1.5.2反向键合相色谱法分离原理

本实验中所用色谱柱为反向键合色谱柱。在反向键合相色谱法中使用的是非极性键合固定相，它是将多孔微粒硅胶载体经过酸活化处理后，与含羟基链（C4、C8、C18，本实验所用为C18色谱柱）或苯基的硅烷化试剂反应，生成表面具有烷基或苯基的非极性固定相。

反相色谱的分离机理，吸附色谱的作用机制认为溶质在固定相上的保留主要是疏水作用，在高效液相色谱中又被称为疏溶剂作用。即当溶质分子进入极性流动相后，占据流动相相应的空间，而排挤一部分溶剂分子。溶质分子被流动相推动与固定相接触时，溶质分子的极性部分或非极性因子会将非极性固定相上附着的溶剂膜推开，而直接与非极性固定相上的烷基官能团结合（吸附）形成配合物，构成单分子吸附层。这种疏溶剂的吸附作用是可逆的，当流动相极性减少时，这种疏溶剂斥力下降，发生解离，并将溶质分子解脱。反相色谱中疏水性越强的化合物越容易从流动相中挤出去，在色谱柱中滞留的时间也长，所以反相色谱法中不同的化合物根据他们疏水特性得到分离。

1.5.3高效液相色谱中流动相的选择

与气相色谱分析不同，液相色谱中不同种类的流动相能显著改善柱效率，应尽可能选择高纯度试剂作为流动相，防止微量杂质长期积累损坏色谱柱，使检测器噪声增加或在制备色谱中收集馏分的纯度降低。要求选择流动相的价格便宜、毒性小、易于纯化。还应选择粘度较小的流动相，否则会降低试样组分的扩散系数，减慢传质速率，柱效下降。通常，流动相的表面张力越大，介电常数越强，此时溶质与烷基键合的配位能力越强，流动相的洗脱强度越弱，溶质的保留值越大。

1.5.4高效液相色谱色谱柱柱效的评价

一般硅胶柱以笨、萘、联苯及菲为样品，以无水己烷为流动相。本实验作用色谱柱为反相色谱柱，需要以尿嘧啶、硝基苯、萘和甲醇配置的硅胶柱为样品，以甲醇-水（85-15）（v/v）或乙腈-水（60-40）（v/v）为流动相，测得各组分的W1/2和tR，求出理论塔板数及相邻组分的分离度R，依此做出HPLC色谱柱柱效的评价。

1.5.5高效液相色谱与其他色谱分析相比的优点

（1）应用范围广。在数量庞大的化学物质中80%都可以用HPLC进行分析，尤其对不适用与气相色谱分析的物质：不易挥发的物质、热不稳定的物质、离子型物质、高分子物质或生物大分子物质。

（2）检测灵敏度高。HPLC可配备多种不同类型的色谱柱，也可以安装多种高灵敏度的检测器，可以进行微量样品或痕量样品的分析。

（3）分析速度快。HPLC的一大优势便是配备有高压泵，可以使用高压泵恒压恒的输送流动相，极大地缩短了分析时间，并且色谱柱可以多次重复使用。

（4）高选择性。由于HPLC采用高效固定相填充色谱柱，固定相粒度均匀，表面空隙浅，质量传递速度快，因此柱效很高，理论塔板数可以多达5000-30000以上，并且可以控制流动相来达到分离效果，因此，HPLC不仅可以分离不同类型的有机物及同分异构体，还可以采用手性柱分离旋光异构体。 新药尼拉帕尼分析方法的研究(4):http://www.chuibin.com/yixue/lunwen_205361.html