样本进行SCX分级后，每次收集穿流及洗脱片段约40份，40份片段根据SCX色谱图合并成6份，将合并后的样本冻干后C18 Cartridge（Sigma）脱盐。

2.4.3毛细管高效液相质谱检测及鉴定

毛细管高效液相色谱：分级样品采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC进行分离。色谱柱以95%的A液平衡（缓冲液A液为0.1%甲酸水溶液）。样品由自动进样器上样到上样柱Thermo scientific EASY column(2cm*100μm 5μm-C18)，再经分析柱Thermo scientific EASY column(75μm*100mm 3μm-C18)分离，流速为250nl/min。相关液相梯度如下：0分钟-105分钟，B液线性梯度从0 % 到50%；105分钟-110分钟，B液线性梯度从50%到100 %；110分钟-120分钟，B液维持在100%（B液为0.1%甲酸乙腈水溶液，84%乙腈）。样品经毛细管高效液相色谱分离后用Obitrap-Elite质谱仪（Thermo Finnigan）进行质谱分析。

质谱鉴定：分析时长为120 min，检测方式为正离子检测，母离子扫描范围：300-1800 m/z， AGC target：3e6，一级质谱分辨率：70,000 at m/z 200，一级Maximum IT ：10 ms， Dynamic exclusion：40.0 s ，Number of scan ranges：1。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后采集10个碎片图谱（MS2 scan），Isolation window：2 m/z，MS2 Activation Type: HCD，二级质谱分辨率：17,500 at m/z 200，二级Maximum IT：60 ms，Microscans：1， Underfill ratio：0.1 % ，Normalized collision energy：30eV。

2.4.4质谱数据的统计分析

本课题使用Protein Discovery 1.4软件对质谱分析的原始RAW文件进行查库，从而对差异蛋白进行鉴定、定量和数据分析。使用数据库为Uniprot_human_20150723_147897.fasta（蛋白质序列共147897条，下载日期为20150723）。搜库参数如下：单一同位素峰检测，胰酶酶切，允许最大两个漏切位点，iTRAQ-8plex（K）、iTRAQ-8plex（N-Term）和Oxidation（M）为可变修饰，Carbamidomethyl（C）为固定修饰，肽段价态为：2+、3+和4+，母离子误差：20ppm，MS/MS 误差 0.1Da。软件可鉴别样品所在标签的信号强度值与内标的信号强度值的比值，以抽提肽段报告离子峰强度值信息和肽段定量结果作为为参考，对差异蛋白进行定量。蛋白质定量结果为鉴定肽段定量结果的中位数。蛋白质检索结果使用Protein FDR≤0.01，PSM FDR≤0.01筛选过滤，变化倍数< 0.8为下调蛋白，变化倍数> 1.2为上调蛋白。

2.4.5生物信息学分析

利用DAVID（version:6.8, https://david.ncifcrf.gov）进行Gene Ontology（GO）功能分析，对蛋白进行细胞成分，分子功能和生物过程的功能分类分析和功能富集分析。

利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库进行信号转导通路分析。

利用 Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins（STRING）软件（http://string.embl.de/)进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。

3实验结果与分析

3.1脾肾阳虚组特征蛋白筛选

通过iTRAQ标记及LC MS/MS分析，比较健康对照组，脾肾阳虚证组，肺肾阴虚证组，肺脾气虚证组四个样本。iTRAQ报告离子强度比值被用于计算蛋白表达的倍数变化，得到结果为：四组总蛋白有260个，总肽段有1753个，唯一性肽段有1379个。脾肾阳虚证组与健康对照组、肺肾阴虚证组、肺脾气虚证组三组iTRAQ报告离子强度比值均> 1.2或< 0.8的差别表达蛋白质为51个，见表3-1，为儿童哮喘缓解期脾肾阳虚证组的特征性蛋白