卡拉胶对食品蛋白质消化性的影响(3)
1.2.2.2 用胃蛋白酶来消化卡拉胶蛋白复合物
经过反复多次试验最终确定合适的胃蛋白酶浓度，胃蛋白酶与蛋白质质量比为1：100。消化样品在37℃水浴，90rmp条件下，定时5 10 30 60 90 120分钟时取样，取样前在1.5mL的离心管内加入20μL的浓度为0.5mol/mL的NH4HCO3。同时，卡拉胶—乳清蛋白复合物消化前后分别用扫描电镜进行结构分析。
1.2.3 流变特性测定
卡拉胶—蛋白质复合物在胃液中消化后的流变特性使用流变仪(Anton Paar, Physica MCR 301, Austria)进行测定。样品处理后的直径约为50mm，厚度大约为2mm。使用100mlL烧杯，用注射器吸取20ml卡拉胶—乳清蛋白混合液注射到20mLSGF中形成一个直径约为50mm的凝胶块，测定前将凝胶块与SGF一起放置于冰箱（4℃）过夜使pH值平衡。次日将凝胶切割成直径为50mm 高为2mm的圆柱体，使样品均匀分布铺满整个板的表面区域。然后在室温25℃下，以1Hz，0.5%应变测定样品的储能模量和损耗模量，表征其成胶强度。
1.2.4 SDS-PAGE电泳
用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）来分析不同质量比得卡拉胶—乳清蛋白凝胶的消化情况的变化。制备5%的浓缩胶和12%的分离胶。使用的仪器为Bio-Rad Miniprotein 3 unit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)，上样样品在加入电泳槽之前在95℃下加热十分钟，然后在1350rmp下离心十秒钟后用移液枪吸取10μL进行上样，其中marker上样量为5μL。电泳结束后，在摇床转速50-60rmp下，使用考马斯亮蓝染色R250在乙酸:甲醇:水(1:5:4)染色溶液中进行染色，用乙酸:甲醇:水(1:3:8)配置的脱色液进行脱色处理。用凝胶成像系统 (Clinx Science Instruments, Shanghai, China)拍电泳凝胶照片。
1.2.5 扫描电镜
将卡拉胶—乳清蛋白混合液加入到SGF中形成的凝胶，放入NaOH溶液保持变量唯一，保持最初的凝胶微观结构。同样方法制作凝胶，加入胃蛋白酶，使胃蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1:100，消化1小时。将NaOH溶液对已经消化了1小时的凝胶进行失活处理。将凝胶样品用双面刀片切成面积≤6×6mm2，厚度≤2mm的薄片。用合适的清洗液反复清洗样品表明的灰尘、蜡质层、杂质等附着物。两个经过上述处理后的凝胶标本在40℃下放置在2.5%戊二醛中过夜处理。用0.1mol磷酸缓冲液每隔10min冲洗一次，一共进行三次。洗涤凝胶样品使用50%、70%、80%、90%浓度的乙醇水溶液进行脱水处理，脱水时间为15min，100%乙醇脱水3次，每次30min。用叔丁醇置换3次，每次30分钟。用冷冻干燥仪干燥表面。脱水样本达到干燥临界点后使用Sputter Coater (EMS575X, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)进行扫描电镜分析。使用加速电压为15KV的SEM (S-3000, Hitachi Science System Ltd., Hitachinaka, Japan)进行扫描，观察结果。获得放大一定倍数的数码显微图。
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