新型N-糖酰胺酶PNGase Stca的克隆表达与特性研究(2)
(三)PNGase Stca的酶学性质研究 6
2.6 重组PNGase Stca最适反应条件的测定 6
2.6.1 实验准备 6
2.6.2 反应体系 7
2.6.3 酶最适pH的测定 7
2.6.4 酶最适温度的测定 7
2.7 重组PNGase Stca底物特异性的测定 7
2.7.1 实验准备 7
2.7.2 反应体系 8
2.7.3 酶促反应研究底物特异性 8
2.8 UPLC检测重组PNGase Stca酶对底物的去糖基化作用 8
2.8.1 N-糖链的纯化 8
2.8.2 2-AB标记 8
2.8.3 色谱分析 9
（四）PNGase Stca基因的定点突变实验 9
2.9 PCR扩增目的基因 9
2.9.1 PCR反应体系 9
2.9.2 引物 9
2.9.3 PCR反应程序 10
2.9.4 突变基因的酶切筛选 10
2.9.5 转化与测序 10
2.10 获得重组E.coli BL 21细胞 11
2.10.1 重组E.coli TOP 10细胞的纯化培养 11
2.10.2 质粒的提取 11
2.10.3 重组质粒的转化 11
2.11 突变基因编码PNGase Stca的酶学性质研究 11
3 结果分析 12
3.1 重组PNGase Stca基因诱导表达产物的SDS-PAGE分析 12
3.2 UPLC色谱分析结果 12
3.2.1 pH值对重组PNGase Stca酶活性的影响 12
3.2.2 温度对重组PNGase Stca酶活性的影响 13
3.2.3 UPLC检测重组PNGase Stca酶对不同底物的去糖基化作用 14
4 结论 17
致谢 18
参考文献 18
图3-1 SDS-PAGE电泳结果 12
图3-2 不同pH对重组PNGase Stca酶活性的影响 13
图3-3 不同温度对重组PNGase Stca酶活性的影响 13
图3-4 重组PNGase Stca及PNGase F与RNase B作用酶解产物的UPLC结果 14
图3-5 重组PNGase Stca及PNGase F对Lactoferrin酶解产物的UPLC结果 15
图3-6 重组PNGase Stca及PNGase F对HRP酶解产物的UPLC结果 16
图3-7 重组突变型和野生型PNGase Stca与HRP作用酶解产物的UPLC结果 17
表2-1 SDS-PAGE凝胶组成 6
表2-2 CIT缓冲液组成 6
表2-3 PNGase Stca酶反应体系 7
表2-4 PNGase Stca及PNGase F酶促反应体系组成 8
表2-5 PCR反应体系组成 9
表2-6 PNGase Stca基因定点突变PCR反应引物 10
表2-7 定点突变基因PCR反应程序 10
新型N-糖酰胺酶PNGase Stca的克隆表达与特性研究
糖蛋白上的糖链在细胞识别、信号转导、分化发育、免疫应答等多种生命活动中起着重要的生物学作用[1, 2]，因此糖链的研究对于生理学和医学领域的发展十分重要。糖链的获取通常需要使用糖酰胺酶，如为了研究自然界中较常见的N-糖链，目前多用N-糖酰胺酶进行酶解。当前研究较为充分的PNGase A和PNGase F两种酶均有优势，但也存在明显的缺陷，PNGase A只能作用糖肽、有自身去糖基化风险、不能在原核生物系统中表达[3]；PNGase F则不能作用于含α-1,3-核心岩藻糖结构的糖蛋白[4,5]。二者均不能完全满足糖组学飞速发展的需要，因此对N-糖酰胺酶进行进一步开发和研究具有重要意义。