纳米磷脂盘的装配应用于膜蛋白复合物的结构功能研究(2)
1.3.3利用纳米磷脂盘构建具有生物学功能的膜蛋白复合物单元 7
1.4本设计的主要研究内容及实验方案 8
1.4.1研究内容和目的 8
1.4.2实验方案 8
1.4.2.1 大肠杆菌茄红素生产菌株的建立 8
1.4.2.2 茄红素生产菌株优化 8
2 大肠杆菌茄红素生产菌株的建立 8
2.1 本章的实验试剂和仪器 9
2.2 大肠杆菌茄红素生产菌株的建立 10
2.2.1 实验部分 10
2.2.1.1 DH5α的平板扩增 10
2.2.1.2 目标质粒转化DH5α 10
2.2.1.3氯霉素平板刷选阳性克隆 11
2.2.1.4产物番茄红素的提取与吸光度测定 11
2.2.1.5转化菌的保种与质粒小提 12
2.2.2实验结果分析与产物番茄红素的表征 13
2.2.2.1实验结果分析与讨论 13
2.2.2.2细菌产物番茄红素表征 14
2.3本章小结 15
3 番茄红素产生系统生长环境的选择与优化 15
3.1本章的实验试剂和仪器 15
3.2实验部分 16
3.2.1 四种培养基的配制 16
3.2.2 转化菌的不同培养基培养和OD600值测定 17
3.2.3 转化菌产物的含量测定 17
3.3 实验结果分析 17
3.3.1在不同培养基中空载菌株和转化菌株的生长曲线 17
3.3.2转化菌产物的含量测定结果分析 21
3.4 本章小结 23
4 本文结论与成果 23
4.1本文结论 23
4.2本文成果 23
4.3后续工作展望 24
致 谢 25
参考文献27
1 绪论
膜蛋白是一类附着或者插入细胞膜结构的蛋白质的总称，它是生物膜功能的主要承担者。由于其表达量通常较低，加上在体外研究中膜蛋白需要文持脂双层膜或类脂环境才可以保持其活性状态,膜蛋白的研究一直滞后于水溶性蛋白。由于膜蛋白的两亲性，体外研究中一般是将其包裹在洗涤剂胶束或是脂质体中进行。洗涤剂胶束固有的化学特性以及单层膜结构无法为膜蛋白提供一个良好的膜环境，其本身易于自组装也会影响膜蛋白的结构和活性[1]。脂质体类膜体系更加接近于体内膜环境，但其制备不能被设计、实验缺乏重现性，会产生各种异质小泡，不可避免地会给后续的分析带来相当大的难度[2]。这些因素阻碍了膜蛋白的研究和分析。
磷脂纳米盘(Nanodisc)是近年来由高密度脂蛋白发展而来的用于膜蛋白研究的新型类膜结构，来发展起来的一种膜蛋白研究手段。它能提供一个稳定可控的、单分散性的、接近生物体脂质双分子层的人造膜环境，不仅可以保护膜蛋白的结构和功能而且可以通过蛋白质工程手段修改高密度脂蛋白的一级结构以适应不同膜蛋白研究需要。这些优点较洗涤剂胶束和脂质体在膜蛋白研究中有明显的优势，也使得纳米磷脂盘系统成为研究膜蛋白的功能的全新的平台。
本研究的目标是建立基于Nanodisc的虾青素合成途径的质谱分析方法，利用Nanodisc整合β-胡萝卜素羟基化酶和β-胡萝卜素羰基化酶实现气相转移，利用质谱分析它们的生物活性与化学计量，相互作用以及空间构象之间的关系。我们的最终目的是通过质谱的方法建立优化虾青素合成的体外“纳米反应器”，将多个参加代谢途径的酶利用纳米磷脂盘予以整合，为膜蛋白类的生物酶的固定化研究开展先期尝试。为实现这一目的，我们将首先制备并且优化可以生产底物的工程菌株，因此本毕业设计的目的是建立虾青素合成前体茄红素的表达体系及其体外定性定量分析方法，为进一步的研究打下基础。