4 讨论 18

参考文献： 18

致 谢 19

1 引言

1.1 无缝克隆技术概述

分子克隆是一种利用体外重组技术将特定基因插入载体分子中，从而实现在分子水平上扩增特定DNA片段的方法，是基因工程的一种重要技术手段。最常用的基因克隆方法是在PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，利用限制性内切酶酶切构建载体，再在连接酶的作用下将同样经限制性内切酶切割得到的带有相同黏性末端的目的基因片段与载体连接。但是这种方法操作复杂，酶切效率和连接效率不高，使得目的基因片段成功插入载体有一定的困难，难以满足高通量需求。[1,2] 

无缝克隆技术是近年发展起来的一种DNA定向克隆方法，该技术简单、快速并且高效，一次性允许两个或更多DNA片段精确连接，并不受酶切位点的限制，可以实现高通量构建载体。[2] 

1.2 无缝克隆技术的应用

无缝克隆技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用，如基因和蛋白质标记，报告基因研究，结构域交换研究，诱变研究和基因插入或敲除实验等。[3] 

分子进化方法，如外显子和DNA改组，用于生产具有所需生物化学或生物物理特性的蛋白质，就需要无缝拼接各种功能元件，以加快基因进化速度。[4] 在真核细胞中，可以通过内含子介导的RNA剪接产生嵌合基因或蛋白质。[5,6]在这些实验中，合成RNA底物和外显子标记的核酶通常需要仔细设计和产生嵌合前体基因。只要嵌合基因正确生成，就可以在拼接时实现无缝融合。

蛋白质是由功能域组成，为了阐明特定结构域在特定蛋白质中的功能，常常需要具有缺失结构域或被同源蛋白质的类似结构域取代的结构域的突变蛋白质。这些的实现往往需要无缝克隆技术。即各种结构域的无缝克隆对于蛋白质工程学至关重要，包括新型杂合分子和抗体工程的产生。[7] 嵌合蛋白也可以通过内含肽介导的蛋白质剪接和连接产生。[8]只要含有内含肽的前体蛋白无缝地生成，就可以实现精确的蛋白质融合。在大肠杆菌中生产具有N-末端残基的蛋白质的实用方法是将它们表达并纯化为具有N-末端标记的融合蛋白。纯化后，如果需要再折叠，可通过特异性工程蛋白酶切割除去标记和任何不需要的氨基酸残基。该过程也需要蛋白酶切割位点和目的的蛋白质之间的无缝连接。[7] Moguilevsky等人[9]在大肠杆菌中生产成熟的人Apo A-I时发现，泛素标记是最直接的在体内和体外产生具有天然N-末端残基的蛋白质方法之一。

模型生物中的靶向基因敲除和插入技术为体内基因功能分析提供了强大的遗传工具。该过程通常包括删除整个开放阅读框（ORF）或编码特定结构域的部分，并且在某些情况下用突变等位基因或直系同源物的序列替换这些。这些研究需要产生敲除和敲入构建体，其中所有需进行同源重组功能元件都是精确连接的。无缝克隆技术将极大地促进这些研究的构建。对于动物病毒和疫苗载体的分子和病原学研究，通常需要合成整个病毒基因组或人工构建混合病毒载体。Yount等人 [10] 就利用无缝克隆技术成功地从多个PCR片段中组装了一个31.5Kb的重组病毒基因组。

1.3 无缝克隆技术研究进展

在发明PCR之前，DNA片段的无缝融合是通过一些复杂的程序实现的，通常包含使用基于细菌噬菌体M13的定点诱变、寡核苷酸引物、寡核苷酸接头和外切核酸酶，随后在大肠杆菌中扩增质粒。在某些情况下，它是利用RecA依赖性同源重组实现的。这些过程需要精心设计目标结构，并且操作费力。 引物桥接克隆方法研究(2):http://www.chuibin.com/shengwu/lunwen_206335.html