家猪13/17罗伯逊易位染色体着丝粒的研究 第9页
（10）检测缓冲液：Tris碱6.06g，NaCl2.93g，MgCl2溶于500ml水中调pH=9.5。
（11）NBT储存液：0.5gNBT溶于10mL的70％DMF(二甲基甲硝铵)，-20℃避光保存。
（12）BCIP储存液：0.5gBCIP溶于10mL的100%DMF(二甲基甲硝铵)，4℃避光保存。
（13）显色液：避光条件下，40μLNBT储存液，与10mL检测缓冲液充分混匀，再加入40μLBCIP储存液，轻轻混匀。
2 试验方法
2.1探针的标记
通过PCR反应可将带有半抗原的dNTP掺入到探针中。PCR标记的效率较高。标记物为DIG-11-dUTP。
PCR反应体系： 10×PCR Buffer 2µL
DIG-11-dUTP 0.5μL
dNTPs Mixture 1.5µL
Taq DNA polymerase 0.2µL
通用引物M13 RV 1µL
通用引物M13 M3 1µL
阳性克隆子 2µL
dd H2O 16.8µL
共计 25µL
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s (35个循环) ；72℃延伸10min。
2.2 探针纯化
在扩增好的PCR产物中加入50μL冰冷的无水乙醇，-20℃放置2-3h，加入4mol/L Licl50μL，10000r/min离20min，弃上清，加入适量的DNA DilutionBuffer溶解探针。
2.3探针标记效率检测
（1）剪一小块尼龙膜，打好方格，先在去离子水中浸泡10min，至膜完全浸透。
（2）将标记的探针和阳性DNA稀释。
DIG标记的对照阳性DNA的初浓度为：8ng/μL，1为标记的DNA探针，2为阳性对照DNA，用Buffer先稀释100倍，然后逐级按10稀释。如表3-1所示：表3-1 标记探针和阳性 DNA 的稀释（单位: μL）
Table3-1 The dilution of Labeled DNA and Control DNA
类别 1 2 3 4 5
标记探针 1:10 1:102 1:103 1:104 1:105
阳性DNA 1:10 1:102 1:103 1:104 1:105
（3）待膜充分凉干，将稀释好的标记的DNA探针及DIG标记的对照阳性DNA点在膜的方格上，每个点分别点10μL，阳性DNA的量约从5×10-2-5×10-6ng。
（4）待膜晾干后在80℃烤箱中烘烤3h。
（5）将膜置于20mL马来酸缓冲液中在摇床上摇2min。
（6）10mL封阻剂正反面各孵育30min。
（7）抗体孵育30min。
（8）在10mL冲洗缓冲液中洗两次，每次15min。
（9）于10mL检测液中显色到出现目的色为止，加TE或水终止显色。
2.4 荧光原位杂交
2.4.1染色体标本片的预处理
（1）3:1的甲醇/冰醋酸固定液固定30min，60℃烤片60min。
（2）0.02%的胃蛋白酶37℃孵育标本片10min。
（3）2×SSC洗涤2次，每次5min。
（4）70%，85%，100％乙醇逐级脱水，每次5min，直立干燥。
（5）75℃预热的变性液中变性5min。
（6）冰冷的70%，85%，100％乙醇逐级脱水，每次5min，直立干燥。
2.4.2 探针的变性
标记好的探针加入杂交液中，95℃变性7min，立即置于冰上骤冷10min。
2.4.3 杂交
经预处理的标本片预热至37℃，加40μL杂交液于目的染色体标本靶位置处，盖盖玻片，80℃共同放置3min，37℃湿盒内杂交过夜。毕业论文http://www.751com.cn/ 论文网http://www.lwfree.com/
2.4.4 杂交后的处理
（1）洗液Ⅰ42℃洗片3次，每次5min。
（2）洗液II37℃洗2次，每次5min。
（3）洗液III室温洗一次，5min。
（4）封闭液37℃封闭30min。
（5）洗液III简单冲洗。
（6）加稀释好的荧光标记的抗地高辛抗体，避光，37℃孵育60min。
（7）洗液III洗片3次，每次5min。
（8）避光条件下，吸50μLDAPI滴于片上进行复染，复染后用2×SSC快速冲洗，乙醇逐级脱水干燥。盖上盖片，用指甲油封片。锡箔包装以避光，贮存于4℃。
2.5 杂交后的观察
OLYMPUS-BX60型荧光显微镜观察，OLYMPUS冷CCD数码成相系统照相，IPP5.0软件进行处理。
3.实验结果与分析
3.1地高辛标记检测结果
通过地高辛配基标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(Dig-dUTP),随机插入结合在标记产物中，使其分子量增大，故电泳检测表现为滞后于未标记DNA（如图4所示）。同时，通过化学显色底物NBT/BCIP系统检测标记效率。表明标记DNA在稀释到105倍时仍然显色（如图5所示）。说明DNA序列已经成功被Dig标记，标记效果良好。
图3-4：地高辛标记电泳检测结果
M：DL2000 DNA marker；1，3：DIG标记产物；2，4：未标记产物。
Fig.3-4 detection of digoxin mark
M：DL2000 DNA marker；1，3：DIG marked；2，4：without DIG marked
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