家猪13/17罗伯逊易位染色体着丝粒的研究 第5页
道[62]。1989年孙金海等在国内加系长白猪群中首次发现13/17罗伯逊易位，并于1991年通过遗传手段在国内外首次培育了一种染色体数目为36条且能稳定遗传的新类型家猪[2n=36，XX或XY，rob（13；17）]，近十几年来利用现代细胞遗传学、数量遗传学、分子遗传学等研究方法，对该染色体罗伯逊易位猪群的种质特性、遗传效应、杂交利用等进行了深入系统的研究，并取得了许多重要的研究成果[63-69]。提出了对13/17易位家猪的利用问题:一方面可以把13/17易位纯合子猪作为二元或三元杂交的终端杂交父本来进行商品瘦肉型猪的生产;另一方面可以通过杂交的方法把13/17易位染色体导入另一高产品系来进行四系配套商品瘦肉型猪的生产,两个母本或父本品系为13/17易位纯合子猪(2n=36),另外两个品系为具有正常核型的猪(2n=38),商品猪全部为13/17易位杂合子猪(2n=37)。这样在不增加投入的情况下,对商品瘦肉型猪的生产可望获得更高的经济效益。
2.4罗伯逊易位的理论研究
罗伯逊易位染色体的类型的确定是罗伯逊易位研究中的首要问题。染色体检查是用外周血在细胞生长刺激因子作用下经37℃，72小时培养，获得大量分裂细胞，然后加入秋水先素使进行分裂的细胞停止于分裂中期，以便染色体的观察；再经低渗膨胀细胞，减少染色体间的相互缠绕和重叠，最后用甲醇和冰醋酸将细胞固定于载玻片上，在显微镜下观察染色体的结构和数量。
带型分析是以前研究的主要手段，在同一物种中，两条同源染色体的带型一般是相互吻合的这就为确定发生罗伯逊易位的染色体之间的关系提供了依据。G带、C带、R带、银染（NORs）带、T带、Q带等分带技术都曾应用于此项研究中，其中G带、C带、R带是最常用的。更值得一提的是，至今这些分带技术仍是研究罗伯逊易位的重要手段。伴随着生物技术方法的进步，在这些传统的分带研究的基础上，也应用电镜联会复合体[70-73]（synaptonemalm complexes,SCs）观察，荧光原位杂交（flourescence in situ hybirdization,FISH）、显微切割、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）等技术，以扩大罗伯逊易位研究的领域和范畴。
自然界中,单个物种内的罗伯逊易位与染色体臂间和臂内倒位、易位、缺失、异染色质增生等同属于染色体变异类型,它对生物自身的影响也是非常广泛的。孙金海等在研究国内长白猪中,发现了13/17罗伯逊易位,但该种易位对猪的繁殖力及生长速度方面不但没有负效应,而且在生长速度方面还存在一定的优势[74]。
目前，在罗伯逊易位的研究中，还存在很多问题有待解决。首先，罗伯逊易位作为物种核型进化的一个重要来源是无可争议的，但究竟是以断裂为主，还是以融合为主？这就涉及到核型进化中的染色体是越来越多还是越来越少的问题。此外，罗伯逊易位对易位染色体及其他染色体有何影响，以及它在物种进化中扮演什么样的角色？这些问题既要借助古生物学和古地理学的指示，也需要现代日益发展的分子生物学知识和技术来解决。总之，随着罗伯逊易位研究的不断深入，必将加深我们对进化生物学的理解，同时在实验生物学、医学遗传学及遗传育种学等方面也将具有重要的实践意义。
3荧光原位杂交技术研究进展
3.1荧光原位杂交
由Gall和Pardue 1969年建立的原位杂交技术，突破了实体瘤染色体分析的技术“瓶颈”，使实体瘤的细胞遗传学研究进入了一个新的时期[75]。荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)技术是80年代中期发展起来的非放射性原位杂交技术[76]。其原理是将直接与荧光素结合的寡聚核苷酸探针（或采用间接法用生物素、地高辛等标记的寡聚核苷酸探针）与变性后的染色体、细胞、组织中的核酸按照碱基互补配对原则进行杂交，经洗涤后直接检测或通过免疫荧光系统检测，最后在荧光显微镜下观察。与其它原位杂交技术相比，FISH的优点是：①敏感性高，特异性强，背景低；②快速方便；③宜于多靶杂交，对同一标本同时进行多个探针杂交，不同的探针可以显示不同的荧光颜色。FISH技术的应用已经证实或发现了用经典细胞遗传学方法无法证实或发现的肿瘤染色体改变，成为衔接细胞遗传学和分子遗传学之间的一座桥梁。
3.2荧光原位杂交技术的发展
在2 0世纪 9 0年代，FISH在方法上逐步形成了从单色向多色、从中期染色体FISH向粗线期染色体FISH再向fiber —FISH的发展趋势，灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。
3.2.1多色荧光原位杂交
多色原位杂交( M—FISH)，“ M” 分别代表“ Multicolor”、“Multiplex”和“ Multitarget”3种类型。M—FISH的最大特点是：可将多次繁琐的FISH实验和多种不同基因的定位 在一次FISH实验中完成。Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素(AFA)标记探针建立了双色FISH技术。1990年Nederlof等提出用3种荧光素探测3种以上的靶位DNA序列，创建了多色FISH方法。以下五种方法是在多彩色FISH基础上发展起来的新技术。
3.2.2染色体描绘
是用全染色体或区域特异性探针，通过多彩色FISH使中期细胞特异染色体和间期核呈现不同荧光颜色的条带， 从而分析染色体的方 法， 常用于识别染色体重组、 断裂点分布、 鉴别染色体外核 物质的起源。反转染色体描绘是用筛选出的畸变染色体与正常染色体杂交来分析畸 变染色体的方法， 它不仅能区分标志染色体的来源，而且能 分辨间隙易位和复杂的标志染色体[77]。多彩色原位启动标记是用寡核苷酸作为引物，原位 P C R扩增待测序列，并在此过程 中掺入荧光素直接或间接标记的核苷三磷酸，使扩增出的 序列都得以标记。通过几轮这样的扩增，使待检的几个序 列的原位扩增产物标记上不同荧光素，实现同时对多个微 小缺失和突变等染色体微小改变的检测。这方法已常规用于检测特异性a卫星序列在染色体和间期核内的定位[78]。
3.2.3 间期细胞染色质纤维杂交
原位杂交通常是染色体或完整的间期细胞核作为杂交靶，由于材料本身和制片技术的特点，不可能使分辨率达到分子生物学实验的要求。中期染色体高度浓缩，FISH的分辨率大约1-3Mb，这对于鉴别相邻几个kb长度的不同基因，分辨水平远远不够。间期细胞染色质浓缩程度较小，但因受核膜的束缚，常规细胞学制片进行的一般间期细胞杂交的分辨率实际上比中期染色体杂交还低。然而，如果用适当的方法处理间期核，释放出染色质DNA纤维，则可用标记的荧光探针与伸展的染色质DNA纤维进行杂交，此即Fiber-FISH[79-83]。Parra和Windle用变性剂SDS/EDTA处理染色质，让DNA分子从蛋白质中分离出来，双链DNA完全伸展并粘附在玻片上，FISH分辨率达1-2Kb。DNA Fiber-FISH对于高分辨基因物理图的绘制、邻近克隆群的鉴定、染色体微小异常的确定以及癌基因、抑癌基因的定位克隆等都具有重要的应用价值。
3.2.4比较基因组杂交（CGH）
随着分子细胞遗传学研究的不断深入，人们发现FISH技术尽管敏感性高，特异性强，但对来源不清的异常染色体或染色体片段，面临的首要问题是探针的选择。常规染色体涂染技术只能显示一至几条染色体，逐一进行杂交，不仅工作量大、费用高，而且对于整个基因组来说，确定染色体未知区域的扩增或重复，常规的FISH方法几乎是不可能的。这一问题在比较基因组杂交（Comparative genomic hybridization, CGH）问世后得到了一定程度的解决。
CGH是双色荧光原位杂交与竞争抑制杂交相结合的一种方法. CGH一般只能检出缺失和扩增，难以分析没有拷贝数变化的异常，如倒位和平衡异位，也不能鉴定不平衡易位的具体细节。因此在肿瘤的遗传学研究中，应与常规的FISH技术有机结合起来，充分发挥各自的优点，更好地为基础研究和临床服务。
3.3 荧光原位杂交技术在罗伯逊易位研究中的应用
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